骨形态发生蛋白缓释微球结合富血小板凝胶对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血小板凝胶：是富含血小板的血浆加凝血酶、氯化钙激活形成凝胶状物质。由于它不仅具有加速止血、封闭创面的特点，而且含有丰富的生长因子，能加速创面愈合，加快骨的生长。
复乳法：肽类以及蛋白质等水溶性物质的包封，主要使用W/O/W法，该方法是将肽类以及蛋白质溶解在水溶液中，将得到的水溶液分散在含有可生物降解性高分子的有机溶剂中，形成1次乳剂后，再将其分散在水相中。在此过程中，高分子的溶解度降低，使其固化，形成微球。

背景：在骨组织愈合过程的不同阶段需要不同种类的生长因子协同参与，目前组织工程中对生长因子的递送大多局限于单一种类和单一浓度，其结果往往差强人意。新一代的组织工程材料的研究热点之一就是2种或者多种生长因子的仿生程序式释放，然而目前相关的研究还非常少。
目的：观察包埋骨形态发生蛋白的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球结合富血小板凝胶对人骨髓基质干细胞增殖分化的影响。
方法：①复乳法制作负载骨形态发生蛋白2的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，测定微球包封率、骨形态发生蛋白2的体外释放率及微球形态和体积，将制作满意的微球与激活的富血小板凝胶结合，在聚乳酸-羟基乙酸共聚物三维支架上与人骨髓间充质干细胞的共培养；②将骨髓基质干细胞分为6组：乏血小板血浆组、血小板凝胶组(加入富血小板血浆)、骨形态发生蛋白+乏血小板血浆组、骨形态发生蛋白+血小板凝胶组、骨形态发生蛋白微球+乏血小板血浆组和骨形态发生蛋白微球+血小板凝胶组。各组加入经预处理的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架，观察各组细胞增殖量、碱性磷酸酶活性以及成骨细胞成熟分化的标志物的变化。
结果与结论：加入富血小板血浆的骨髓基质干细胞增殖水平明显高于乏血小板血浆组；联合应用骨形态发生蛋白2的细胞中碱性磷酸酶活性明显高于其他4组；骨形态发生蛋白微球+乏血小板血浆组和骨形态发生蛋白微球+血小板凝胶组中骨桥蛋白和骨钙蛋白mRNA的表达水平明显高于其他4组。提示骨形态发生蛋白缓释微球结合富血小板凝胶有促进骨髓基质干细胞增殖分化的作用。

ORCID: 0000-0003-2143-1195(洪建军)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 缓释材料, 骨形态发生蛋白2, 骨髓基质干细胞, 富血小板血浆, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球, 程序式释放, 骨缺损修复, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Various growth factors together participate in the different stages of bone healing, but the current tissue-engineered materials limited on single type and concentration cannot obtain satisfactory outcomes. There is still a lack of study on the novel tissue-engineered material releasing two or more growth factors in order.
OBJECTIVE: To observe the effect of platelet-rich gel (PRG) combined with poly(lactide-glycolide acid) (PLGA) microspheres encapsulating bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on the proliferation and osteoblastic differentiation of bone marrow stromal stem cells.
METHODS: PLGA microspheres loading BMP-2 were prepared by multiple emulsion method, and the encapsulation rate, morphology and volume of microspheres as well as in vitro releasing rate of BMP-2 were measured. The eligible microspheres combined with the activated PRG were co-cultured with human bone marrow stromal stem cells on the PLGA three-dimensional scaffold. Additionally, bone marrow stromal stem cells were divided into six groups including platelet poor gel, PRG, BMP-2/platelet poor gel, BMP-2/PRG, BMP-2 microspheres/platelet poor gel and BMP-2 microspheres/PRG groups, and the preprocessed PLGA scaffold was added into each group. The DNA content, alkaline phosphatase activity and mRNA expression levels of osteopontin and osteocalcin were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The DNA content of bone marrow stromal stem cells was higher in all PRG scaffolds compared with the platelet poor gel scaffolds. The alkaline phosphatase activity and mRNA expression levels of osteopontin and osteocalcin in the BMP-2 microspheres/platelet poor gel and BMP-2 microspheres/PRG groups were markedly higher than those in the other four groups. These results suggest that the BMP-2 sustained-release microspheres combined with PRG are able to enhance the proliferation and differentiation of bone marrow stromal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Bone Morphogenetic Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

卢晓郎，郑亦静，程涛，叶超，洪建军. 骨形态发生蛋白缓释微球结合富血小板凝胶对骨髓基质干细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 7057-7063.

Lu Xiao-lang, Zheng Yi-jing, Cheng Tao, Ye Chao, Hong Jian-jun. Bone morphogenetic protein sustained-release microspheres combined with platelet-rich gel contribute to the proliferation and differentiation of bone marrow stromal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 7057-7063.

图/表（结果） 5

2.1 骨形态发生蛋白微球的形态扫描电镜下观察到骨形态发生蛋白微球完整性好，不粘连，表面光滑，大小较为均匀(图1A)，平均粒径大小约为9.86 μm(图1C)。微支架中的骨形态发生蛋白微球和骨髓基质干细胞均匀分布于血小板凝胶或乏血小板血浆中(图1B)。

2.2 骨形态发生蛋白微球的包封率及骨形态发生蛋白释放曲线采用双抗体夹心ELISA法测定微球的包封率为76%。骨形态发生蛋白微球投放于DMEM全培养基中于孵箱中培育不同时间骨形态发生蛋白2的释放率见图2。

2.3 骨髓基质干细胞的增殖变化相比于加入乏血小板血浆组，加入富血小板血浆的骨髓基质干细胞的增殖能力明显增加(P < 0.05)，说明富血小板血浆中释放的多种生长因子对骨髓基质干细胞的增殖具有促进作用。而是否加入骨形态发生蛋白2或骨形态发生蛋白微球，对其骨髓基质干细胞的增殖没有明显影响(P > 0.05)，见图3。

2.4 骨髓基质干细胞的分化

2.4.1 碱性磷酸酶在细胞培养的早期，各组细胞中碱性磷酸酶的活性均迅速上升，并于第14天达到最高水平，且骨形态发生蛋白2和富血小板血浆联合培养的细胞中碱性磷酸酶活性明显高于其他4组(P < 0.001)。在第14天之后，各组细胞中碱性磷酸酶的活性逐渐下降，但在下降的过程中骨形态发生蛋白2和富血小板血浆联合培养的细胞中碱性磷酸酶活性仍明显高于其他4组(P < 0.01)。相同条件下投放乏血小板血浆的试验组的碱性磷酸酶的活性明显低于投放血小板凝胶的试验组(P < 0.05；图4A)；且在碱性磷酸酶mRNA 的表达水平上与碱性磷酸酶活性上的表现基本一致(图4B)。

2.4.2 骨桥蛋白和骨钙蛋白mRNA的表达水平骨桥蛋白和骨钙蛋白均是成骨细胞的表型之一，且被认为是成骨细胞成熟分化的重要标志。7 d后，血小板凝胶组、骨形态发生蛋白+乏血小板血浆组、骨形态发生蛋白+血小板凝胶组、骨形态发生蛋白微球+乏血小板血浆组和骨形态发生蛋白微球+血小板凝胶组细胞中骨桥蛋白mRNA表达水平明显高于乏血小板血浆组(P < 0.05)。培养14 d后，各组细胞中的骨桥蛋白mRNA表达水平均有增加，其中骨形态发生蛋白微球+乏血小板血浆组和骨形态发生蛋白微球+血小板凝胶组细胞中的骨桥蛋白mRNA表达水平高于其余4组(P < 0.01)，21 d时各组骨桥蛋白mRNA表达达到最高表达水平(图5A)。骨钙蛋白 mRNA的表达水平与骨桥蛋白 mRNA的表达水平基本相似(图5B)。

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引言

骨形态发生蛋白是广泛存在于骨胶原纤维、骨膜和骨髓基质中的一种酸性糖蛋白^[1]，无种属特异性，且具有跨种属诱导成骨的能力，但骨形态发生蛋白在骨内的含量极微少，约1 mg/kg湿骨，而外源性骨形态发生蛋白来源有限、成本较高，且在体内迅速降解或随体液扩散^[2]，不能均匀、持久地分布在大的骨缺损部位，难以发挥出成骨效应。富血小板血浆是自体全血经浓集、分离获得的血液制品，其所含血小板浓度比全血高四五倍，而且富血小板血浆中的血小板经激活后能释放大量高浓度生长因子^[3-4]，刺激细胞增殖分化^[5]，促进软组织修复^[6-7]。

在人体骨组织自然愈合过程中，需要多种生长因子及信号分子以一种时间/浓度依赖的方式协同参与，细胞在生长的不同阶段对各种生长因子浓度的需求是不同的，如在骨折愈合初期，主要是血小板衍生因子，血管内皮生长因子等细胞因子促进血管生长和骨前体细胞的增殖和迁移，而能促进骨前体细胞增殖并定向分化的生长因子如骨形态发生蛋白2则主要在成骨及塑形阶段持续表达。而目前对组织工程中生长因子的递送大多局限于单一种类和单一浓度，其结果往往差强人意。新一代的组织工程材料的研究热点之一就是2种或者多种生长因子的仿生程序式释放，然而目前相关的研究还非常少^[8-10]。

有研究表明，多种生长因子的协同作用比单一生长因子对细胞的增殖作用强^[11]。实验拟观察包埋骨形态发生蛋白的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球结合富血小板凝胶对人骨髓基质干细胞增殖分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞生物学实验。

1.2 时间及地点实验于2010年11月至2012年5月在温州医科大学附属第二医院骨科实验室完成。

1.3 材料

组织材料：健康志愿者骨髓约5 mL，血液40 mL。志愿者，性别男，年龄24岁，经过体检后证明是健康志愿者。实验已获得志愿者知情同意，符合伦理学要求。

主要试剂及仪器：DMEM完全培养基、胰蛋白酶、牛凝血酶购自Gibco公司；β-甘油磷酸钠购自Sigma公司；骨形态发生蛋白2购自以色列PROSPEC公司；碱性磷酸酶试剂盒购自碧云天公司；聚乳酸-羟基乙酸共聚物购自济南岱罡公司；倒置显微镜购自Karl Zeizz 公司；扫描电镜(Hitachi S-3000N)购自日本日立公司；重组人骨形态发生蛋白2 ELISA试剂盒购自R&D公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓基质干细胞的分离和培养抽取健康志愿者骨髓约5 mL，混入DMEM完全培养基，5×10⁵U/L肝素溶液抗凝，混匀后800 r/min离心5 min，去除上清液，与DMEM完全培养基重新混悬后经滤网过滤后接种于25 mL培养瓶。37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养， 5 d后半量换液，以后每两三天全量换液1次，倒置显微镜逐日观察。待细胞覆盖培养瓶80%以上面积后，用0.25%胰蛋白酶消化，计数，用DMEM条件培养基(含体积分数10%胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸、1×10^-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠传代培养，常规3 d换液1次。传至第3代细胞备用。

1.4.2 富血小板血浆和乏血小板血浆的制备抽取正常健康志愿者血液40 mL，1 000×g离心15 min，取上层血浆，3 000×g离心20 min。上层为清亮的乏血小板血浆，移入另一5 mL离心管中备用。中间层为白色的血小板团轻用吸管吸出移至另一离心管中。用少量乏血小板血浆将血小板团重悬，人工血小板计数，调节成浓度为1×10¹²L^-1的富血小板血浆备用^[12-14]。乏血小板血浆中血小板浓度为1×10¹⁰ L^-1。

1.4.3 复乳法制备骨形态发生蛋白微球取1 mg骨形态发生蛋白2溶于1 mL去离子水得内水相(W1)，取 200 mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于2 mL二氯甲烷得油相(O)，将W1倒入O中，冰浴下以40 W功率超声乳化30 s得W1/O初乳，并缓慢倒入30 mL含2%聚乙烯醇的外水相(W2)中，冰浴下1 000 r/min匀速搅拌5 min，得W1/O/W2复乳，随后将复乳倒入150 mL双蒸水中常压磁力搅拌5 h以挥发有机溶剂，15 000 r/min离心10 min收集，去离子水洗涤3次。冷冻干燥48 h去除微球中水分，于-20 ℃保存。

1.4.4 扫描电镜测量微球的形态与粒径制得的微球置于贴有双面导电胶带的铜板上，将其涂布均匀。扫描电镜下观察微球的表面形态，并随机计数50个微球的粒径，计算平均值。

1.4.5 微球包封率的测定精密称取10 mg微球，加入1.0 mL乙腈，涡旋溶解后16 000 r/min离心10 min弃上清液，沉淀真空干燥过夜后用1.0 mL PBS (0.01 mol/L，pH 7.4)重新分散。再次离心保留上清液。沉淀进一步溶于1 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液，充分涡旋后37 ℃下恒温震荡24 h，合并上清液用0.1 mol/L盐酸调至pH 7.4。重复3次。然后采用ELISA法测定样本中的骨形态发生蛋白2的含量。包封率(%)=聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中骨形态发生蛋白2的测得含量/制备时聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中骨形态发生蛋白2的理论载药量(mg/mg)×100%。

1.4.6 骨形态发生蛋白2微球体外释放率的测定精密称取2.5 mg微球，加入到含5 mL全培养基的培养瓶中，同时使培养瓶中骨髓基质干细胞的密度约为5×10⁹L^-1，骨形态发生蛋白2的质量浓度为100 μg/L；于25 ℃、体积分数5% CO₂孵箱中培养。而后在规定时间点从培养瓶中取出等量培养液分别保存，标记日期，同时往培养瓶中加回同等量培养基。然后采用双抗体夹心ELISA法测定各个时间点取出的样本中的骨形态发生蛋白2的含量后，计算骨形态发生蛋白2微球体外释放率。

1.4.7 聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架预处理聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架由济南岱罡生物科技有限公司提供。聚乳酸∶聚乙酸=75∶25(摩尔比)。孔径大小100-300 μm，孔隙率95%。将大块聚乳酸-羟基乙酸共聚物切成5 mm×5 mm×4 mm小立方体，浸泡于体积分数75%乙醇中消毒24 h，PBS漂洗3次，DMEM孵育 30 min，取出置于无菌纱布上，吸干大部分水分，干燥后备用。

1.4.8 骨髓基质干细胞分组干预将5×10⁹L^-1骨髓基质干细胞分为6组：乏血小板血浆组、血小板凝胶组、骨形态发生蛋白+乏血小板血浆组、骨形态发生蛋白+血小板凝胶组、骨形态发生蛋白微球+乏血小板血浆组和骨形态发生蛋白微球+血小板凝胶组，分别加入10 μL乏血小板血浆、10 μL富血小板血浆、100 μg/L骨形态发生蛋白2+10 μL乏血小板血浆、100 μg/L骨形态发生蛋白2+10 μL富血小板血浆、2.5 mg包埋骨形态发生蛋白2的微球+10 μL乏血小板血浆和2.5 mg包埋骨形态发生蛋白2的微球+10 μL富血小板血浆。各组加入经预处理的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架1个，添加10 μL富血小板血浆激活剂(由1 mL 10%氯化钙与10 000 U牛凝血酶混合而成)，反应30 min后，加入5mL全培养基，于25 ℃、体积分数5% CO₂孵箱中培养。

1.4.9 测定各组细胞中DNA含量取各组培养第1，7，14，21天的三维支架剪成碎片，利用细胞裂解液裂解细胞，制备组织匀浆后，高频声波裂解，溶胞产物在4 ℃，12 000×g下离心5 min。取40 μL的细胞裂解上清液与 160 μL的Hoechst 33258染液混合(1 mg/L)。每个样本的荧光光密度通过荧光计测量，DNA的含量通过对比标准曲线测得，标准曲线通过稀释1 g/L的牛胸腺DNA获得。

1.4.10 碱性磷酸酶活力检测选取各组培养第1，7，14，21天，应用碱性磷酸酶试剂盒对各组细胞进行碱性磷酸酶活力测定。

1.4.11 实时定量PCR检测成骨细胞成熟分化的标志物碱性磷酸酶、骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA的表达各实验组分别在培养1，5，9，14 d后当天进行实时PCR检测。

1.5 主要观察指标骨髓基质干细胞骨碱性磷酸酶和骨钙蛋白 mRNA、骨桥蛋白 mRNA以及GAPDH的表达水平。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示。采用IBM SPSS 17.0软件进行分析，对各组数据进行t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨折不愈合及骨缺损是临床骨科医生时常面对的棘手问题。自体骨及异体骨植骨是临床常用的治疗手段，但是骨材料来源有限并常有免疫排斥及疾病传播的风险。骨组织工程的发展为解决这一问题带来了希望，组织工程包括支架材料，生长因子及种子细胞。选择类似细胞外基质的支架材料及模拟生理浓度的生长因子是构建有功能组织工程骨的前提。

近年来，国内外学者发现富血小板血浆中具有高浓度的生长因子，为全血中的3-7倍。富血小板血浆中加入激活剂氯化钙和凝血酶后迅速形成血小板凝胶，同时血小板凝胶中富集的血小板开始大量释放各种生长因子，浓度为体内正常浓度的4-17倍^[15]，其中血小板衍生因子是刺激骨髓基质干细胞有丝分裂和迁移最重要的因素^[16-17]；转化生长因子β可刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化、有丝分裂^[18]；血管内皮生长因子能促进局部新生血管的形成。总之，富血小板血浆中含有丰富的复合生长因子，而且生长因子浓度和配比符合生理需求，能显著促进骨髓基质干细胞的增殖和局部新生血管的形成^[19-21]。另外，血小板凝胶生物支架呈典型的多孔性结构，透射电镜观察时呈有规律排列的纤维蛋白丝交织而成的多孔网状结构，孔径为200-1 000 μm，孔隙率80%，是制作组织工程骨支架的理想材料^[12]。

尽管有以上诸多优点，但是血小板凝胶作为组织工程支架材料仍有其缺陷。第一，血小板凝胶中血小板脱颗粒释放的生长因子中缺乏骨形态发生蛋白，而骨形态发生蛋白2是促进骨髓基质干细胞分化成熟最重要的因子，其促进骨愈合的作用强于富血小板血浆^[22]，能诱导未分化的骨髓基质细胞分化，表达骨与软骨细胞表型，还能刺激软骨细胞和成骨细胞分化，并提高细胞碱性磷酸酶的活性^[4]。其跨种诱导成骨的能力已被多个研究验证^[5-6]；第二，血小板凝胶具有显著促进骨髓间充质干细胞增殖的能力，但其促进骨髓基质干细胞分化成熟的能力尚有争议^[22-23]；第三，富血小板血浆激活后，超过90%的预先合成的生长因子在1 h内释放完毕，而生长因子半衰期短，体内容易被降解，无法在局部持续发挥促进成骨及血管生成的作用。因此单纯用血小板凝胶作为植骨材料无法满足骨诱导的作用^[23]。Tomoyasu等^[24]报道液态富血小板血浆结合骨形态发生蛋白可以促进成骨细胞的分化成熟。Zhu等^[25]报道血小板凝胶/骨髓基质干细胞/骨形态发生蛋白2的成骨作用强于富血小板血浆/骨髓基质干细胞/骨形态发生蛋白2。

实验结果显示，富血小板血浆组比乏血小板血浆组细胞增殖更快，说明富血小板血浆释放的生长因子对细胞的增殖具有促进作用；骨形态发生蛋白组细胞分化情况最好，即骨形态发生蛋白具有促进细胞分化的作用；骨形态发生蛋白微球组比骨形态发生蛋白组细胞分化效果要好，说明骨形态发生蛋白通过微球的降解缓慢释放比直接投放骨形态发生蛋白效果要好。

实验设计的组织工程骨充分结合了血小板凝胶多孔支架特征及不同材料微球程序式缓释骨形态发生蛋白和血小板衍生因子的特点，微球与骨髓基质干细胞可容纳于血小板凝胶网状结构中，血小板凝胶中丰富的生长因子可短暂刺激骨髓基质干细胞增殖，骨形态发生蛋白/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球持续释放骨形态发生蛋白2可促进增殖的骨髓基质干细胞分化成熟进而促进局部成骨。

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